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    細胞轉染

           細胞轉染(Transfection)是指將DNA或者RNA導入真核細胞中的過程。轉染的目的是產生重組蛋白,或特異性增強或抑制轉染細胞中的基因表達。

           根據導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短,可以分為瞬轉和穩轉。
           

    瞬轉

    穩轉

    導入的DNA沒有整合到基因組中,而是保留在細胞核上

    導入的DNA整合到基因組中

    導入的遺傳物質不傳遞到子代; 遺傳改變只是暫時的

    導入的遺傳物質能夠代代相傳;遺傳改變是永久的

    不需要選擇性篩選

    需要選擇性篩選出穩定轉染的細胞

    DNA載體和RNA都可用于瞬時轉染

    只有DNA載體可用于穩定轉染;RNA本身不能穩定地導入細胞中

    導入的遺傳物質的高拷貝數導致高水平的蛋白質表達。

    單拷貝數或低拷貝數的穩定整合的DNA導致較低水平的蛋白質表達。

    通常在轉染后24-96小時內收獲細胞。

    需要2-3周的時間篩選出穩定轉染的細胞克隆。

    通常不適合使用具有誘導型啟動子的載體的研究。

    適用于使用帶有誘導型啟動子的載體的研究。

    一般常用的方法:脂質體轉染法
           1、材料
           293T細胞、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑(TransFast)
           2、器材
           20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計數板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺式離心機、35mm培養皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD
           3、實驗步驟
           細胞傳代
           (1)試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養皿,離心管。
           (2)棄掉培養皿中的培養基,用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
           (3)用Tip頭加入1mlTrypsin液,消化1分鐘(37。C,5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁,觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
           (4)加入1ml的含血清培養基終止反應。
           (5)用Tip頭多次吹吸,使細胞完全分散開。
           (6)將培養液裝入離心管中,1000rpm離心5min。
           (7)用培養液重懸細胞,細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。
           (8)將合適體積完全培養液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養皿中,使其均勻分布。
           (9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養,第二天轉染。

    滬公網安備 31010702003365號

    公安部備案號31010702003365

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