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    原位雜交
                 熒光原位雜交(FISH

     一、           組織標本的準備

    組織標本經甲醛固定24-48h,常規脫水、透明、浸蠟和包埋;4μm石蠟切片,貼在涂有APES膠的干凈載玻片上。58℃烤8-24h。ISH試劑的配制(所有試劑和用具均用DEPC水處理)。

    二、操作流程: 

    一、雜交片的前處理

    1、常規脫蠟至水。

    2、0.01mol/L,pH8.0 EDTA(0.02 mol/L,pH8.0TB配制)  98℃ 煮 15min;

    3、自然冷卻 15min,蒸餾水洗2-5min;

    4、2μg/ml蛋白酶K(TE配制) 室溫 4min, 0.1mol/L甘氨酸PBS10min.;

    5、蒸餾水洗2-5min;

    6、75%,85%,95%,100%酒精系列脫水各1min;

    二、雜交

    將熒光標記探針加入48ulRNAas PBS溶解,用雜交液(4×SSC,25%去離子甲酰胺, RNAas PBS1:200稀釋,20ul雜交液并覆蓋,55℃雜交90min, 37℃雜交:24h,

    三、雜交后洗滌(洗滌過程應避光)

    (1)將切片浸入雜交后洗滌緩沖液的洗缸中72 30min(洗缸應提前30min放入72水浴鍋內預熱到72,2×10min。

    ★雜交后洗滌緩沖液:2×SSC/0.3% NP-40

    20×SSC pH5.3            100ml

    蒸餾水                        847ml

    NP40                           3ml

    最后體積                     1000ml

    1N NaOH調pH7.0-7.5。

    (2)2×SSC.0.3% NP-40733min。

    0.4×SSC.0.3% NP-40733min

    70%乙醇洗 1min

    (3)每片滴加10μl  DAP1(4,6 diamidino-2-phenylinodole)封片襯染5min。

    (4)不及時觀察,可將切片保存在-20冰箱暗處,觀察時復溫至室溫即可。

        

    滬公網安備 31010702003365號

    公安部備案號31010702003365

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