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    載體構建

    分子克隆與質粒載體構建

    一、服務介紹

    分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用體外重組方法將它們插入克隆載體,形成重組克隆載體,通過轉化與轉導的方式,引入適合的寄主體內得到復制與擴增,然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體,可以得到插入DNA的許多拷貝,從而獲得目的基因的擴增。

     

     二、實驗原理

    外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中,將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒有的特性,即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

     T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分為3步:,T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復合物;然后,酶—AMP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后產生一個新的磷酸二酯鍵,把切口封起來。

     DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法,為了防止載體本身的自連,可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。

     連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下,粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中溫度,即12-16℃,連接12-16h(過夜),這樣既可大限度地發揮連接酶的活性,又兼顧到短暫配對結構的穩定。

     

    三、實驗流程

    目的DNA的擴增和純化;

    連接反應;

    電泳檢測連接產物。

    四、客戶提供

    樣本DNA,基因序列,試劑盒。

     

    五、公司提供

    構建好的載體,電泳膠圖,測序結果。

    實驗周期:大約1-2月。

    滬公網安備 31010702003365號

    公安部備案號31010702003365

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